Jonathan Weissman y sus colaboradores utilizaron su herramienta de secuenciación de una sola célula Perturb-seq en cada gen expresado en el genoma humano, vinculando cada uno con su trabajo en la célula

Por: Eva Federico | Instituto Whitehead

(MIT)-El Proyecto Genoma Humano fue una iniciativa ambiciosa para secuenciar cada pieza de ADN humano. El proyecto reunió a colaboradores de instituciones de investigación de todo el mundo, incluido el Instituto Whitehead de Investigación Biomédica del MIT, y finalmente se completó en 2003. Ahora, más de dos décadas después, el profesor del MIT Jonathan Weissman y sus colegas han ido más allá de la secuencia para presentar el primer mapa funcional de genes que se expresan en células humanas. Los datos de este proyecto, publicados en línea el 9 de junio en Cel, relacionan cada gen con su trabajo en la célula y son la culminación de años de colaboración en el método de secuenciación de una sola célula Perturb-seq.

Los datos están disponibles para que los utilicen otros científicos. «Es un gran recurso en la forma en que el genoma humano es un gran recurso, en el sentido de que puedes ingresar y realizar investigaciones basadas en descubrimientos», dice Weissman, quien también es miembro del Instituto Whitehead e investigador del Howard Hughes Medical. Instituto. “En lugar de definir de antemano qué biología vas a observar, tienes este mapa de las relaciones genotipo-fenotipo y puedes entrar y revisar la base de datos sin tener que hacer ningún experimento”.

La pantalla permitió a los investigadores profundizar en diversas cuestiones biológicas. Lo usaron para explorar los efectos celulares de genes con funciones desconocidas, para investigar la respuesta de las mitocondrias al estrés y para detectar genes que causan la pérdida o ganancia de cromosomas, un fenotipo que ha resultado difícil de estudiar en el pasado. «Creo que este conjunto de datos va a permitir todo tipo de análisis que aún no hemos pensado por parte de personas que vienen de otras partes de la biología, y de repente solo tienen esto disponible para aprovechar», dice el ex postdoctorado de Weissman Lab, Tom. Norman, coautor principal del artículo.

Perturb-seq pionero

El proyecto aprovecha el enfoque Perturb-seq que hace posible seguir el impacto de activar o desactivar genes con una profundidad sin precedentes. Este método fue publicado por primera vez en 2016 por un grupo de investigadores que incluía a Weissman y al profesor del MIT Aviv Regev, pero solo podía usarse en pequeños conjuntos de genes y a un gran costo.

El mapa masivo de Perturb-seq fue posible gracias al trabajo fundamental de Joseph Replogle, estudiante de MD-PhD en el laboratorio de Weissman y coautor del presente artículo. Replogle, en colaboración con Norman, quien ahora dirige un laboratorio en el Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering; Britt Adamson, profesor asistente en el Departamento de Biología Molecular de la Universidad de Princeton; y un grupo de 10x Genomics, se propusieron crear una nueva versión de Perturb-seq que pudiera ampliarse. Los investigadores publicaron un artículo de prueba de concepto en Nature Biotechnology en 2020.

El método Perturb-seq usa la edición del genoma CRISPR-Cas9 para introducir cambios genéticos en las células y luego usa la secuenciación de ARN de una sola célula para capturar información sobre los ARN que se expresan como resultado de un cambio genético determinado. Debido a que los ARN controlan todos los aspectos del comportamiento de las células, este método puede ayudar a decodificar los muchos efectos celulares de los cambios genéticos.

Desde su documento inicial de prueba de concepto, Weissman, Regev y otros han utilizado este método de secuenciación en escalas más pequeñas. Por ejemplo, los investigadores utilizaron Perturb-seq en 2021 para explorar cómo interactúan los genes humanos y virales en el transcurso de una infección con HCMV, un herpesvirus común.

En el nuevo estudio, Replogle y sus colaboradores, incluido Reuben Saunders, estudiante graduado en el laboratorio de Weissman y coautor del artículo, ampliaron el método a todo el genoma. Utilizando líneas celulares de cáncer de sangre humana, así como células no cancerosas derivadas de la retina, realizó Perturb-seq en más de 2,5 millones de células y utilizó los datos para construir un mapa completo que relaciona genotipos con fenotipos.

Profundizando en los datos

Al completar la pantalla, los investigadores decidieron poner en uso su nuevo conjunto de datos y examinar algunas preguntas biológicas. “La ventaja de Perturb-seq es que te permite obtener un gran conjunto de datos de manera imparcial”, dice Tom Norman. “Nadie sabe por completo cuáles son los límites de lo que puede obtener de ese tipo de conjunto de datos. Ahora, la pregunta es, ¿qué haces realmente con eso?

La primera aplicación, la más obvia, fue investigar genes con funciones desconocidas. Debido a que la pantalla también lee los fenotipos de muchos genes conocidos, los investigadores podrían usar los datos para comparar genes desconocidos con los conocidos y buscar resultados transcripcionales similares, lo que podría sugerir que los productos genéticos trabajaron juntos como parte de un complejo más grande.

La mutación de un gen llamado C7orf26 en particular se destacó. Los investigadores notaron que los genes cuya eliminación conducía a un fenotipo similar formaban parte de un complejo de proteínas llamado Integrator que desempeñaba un papel en la creación de pequeños ARN nucleares. El complejo Integrator está formado por muchas subunidades más pequeñas (estudios anteriores habían sugerido 14 proteínas individuales) y los investigadores pudieron confirmar que C7orf26 constituía un decimoquinto componente del complejo.

También descubrieron que las 15 subunidades trabajaban juntas en módulos más pequeños para realizar funciones específicas dentro del complejo Integrator. “En ausencia de esta vista de la situación a mil pies de altura, no estaba tan claro que estos diferentes módulos fueran funcionalmente distintos”, dice Saunders.

Otra ventaja de Perturb-seq es que debido a que el ensayo se enfoca en células individuales, los investigadores podrían usar los datos para observar fenotipos más complejos que se enturbian cuando se estudian junto con datos de otras células. «A menudo tomamos todas las células en las que se derriba el ‘gen X’ y las promediamos juntas para ver cómo cambiaron», dice Weissman. “Pero a veces, cuando eliminas un gen, diferentes células que están perdiendo ese mismo gen se comportan de manera diferente, y ese comportamiento puede pasar desapercibido en promedio”.

Los investigadores encontraron que un subconjunto de genes cuya eliminación condujo a diferentes resultados de una célula a otra era responsable de la segregación cromosómica. Su eliminación estaba causando que las células perdieran un cromosoma o recogieran uno extra, una condición conocida como aneuploidía. “No se podía predecir cuál era la respuesta transcripcional a la pérdida de este gen porque dependía del efecto secundario del cromosoma que se ganaba o se perdía”, dice Weissman. “Nos dimos cuenta de que podíamos cambiar esto y crear este fenotipo compuesto en busca de firmas de cromosomas que se ganaban y perdían. De esta forma, hemos realizado el primer análisis de todo el genoma de los factores necesarios para la correcta segregación del ADN”.

“Creo que el estudio de la aneuploidía es la aplicación más interesante de estos datos hasta el momento”, dice Norman. “Captura un fenotipo que solo se puede obtener mediante una lectura de una sola célula. No puedes ir tras él de otra manera”.

Los investigadores también utilizaron su conjunto de datos para estudiar cómo respondían las mitocondrias al estrés. Las mitocondrias, que evolucionaron a partir de bacterias de vida libre, llevan 13 genes en sus genomas. Dentro del ADN nuclear, alrededor de 1000 genes están relacionados de alguna manera con la función mitocondrial. “La gente ha estado interesada durante mucho tiempo en cómo se coordinan y regulan el ADN nuclear y mitocondrial en diferentes condiciones celulares, especialmente cuando una célula está estresada”, dice Replogle.

Los investigadores encontraron que cuando perturbaron diferentes genes relacionados con las mitocondrias, el genoma nuclear respondió de manera similar a muchos cambios genéticos diferentes. Sin embargo, las respuestas del genoma mitocondrial fueron mucho más variables.

“Todavía hay una pregunta abierta de por qué las mitocondrias todavía tienen su propio ADN”, dijo Replogle. «Una conclusión general de nuestro trabajo es que un beneficio de tener un genoma mitocondrial separado podría ser tener una regulación genética localizada o muy específica en respuesta a diferentes factores estresantes».

“Si tiene una mitocondria que está rota y otra que está rota de una manera diferente, esas mitocondrias podrían estar respondiendo de manera diferente”, dice Weissman.

En el futuro, los investigadores esperan usar Perturb-seq en diferentes tipos de células además de la línea de células cancerosas en la que comenzaron. También esperan continuar explorando su mapa de funciones genéticas y esperan que otros hagan lo mismo. “Esta es realmente la culminación de muchos años de trabajo de los autores y otros colaboradores, y estoy muy complacido de ver que continúa teniendo éxito y expandiéndose”, dice Norman.